Главная / Статьи / Животноводство / Сравнительная оценка диагностической ценности цветного антигена для исследования молока верблюдов

Сравнительная оценка диагностической ценности цветного антигена для исследования молока верблюдов

camel1В данной статье приведены результаты методов изготовления диагностического цветного антигена для исследования молока верблюдов.

 

Бруцеллез – хроническая болезнь животных и человека, характеризующаяся абортами, задержанием последа, воспалением слизистой оболочки матки и нередко поражением суставов. В связи с социальной опасностью бруцеллез включен в список карантинных болезней.

При этом основным источником возбудителя инфекции для поголовья верблюдов являются больные животные разных видов. Данные специальной литературы свидетельствует о выделении бруцелл с молоком у лактирующих животных.

В виду того, что население нередко употребляет в пищу верблюжье молоко, возникает вопрос о его проверке на инфицированность бруцеллами. К тому же, следует отметить, что при заселении бактериями ткани молочной железы в секрете появляются антитела, обнаружение которых позволяет ставить диагноз и решать вопрос о пригодности данного продукта в пищу.

Для проведения диагностических исследований молока верблюдов необходимо иметь ряд компонентов, с помощью которых возможно проводить постановку реакции и осуществлять диагностику и контроль правильности оценки реакции.

Сравнительная оценка методов диагностики бруцеллеза у верблюдов позволяет рекомендовать наиболее чувствительные из них для более полного выявления больных животных в неблагополучном стаде.

 

Материалы и методы исследований

 

При определении оптимальных методов (условий) изготовления диагностического цветного антигена для исследования молока верблюдов было установлено, что параметры изготовления цветного антигена из штамма Brucella abortus 19 полностью соответствовали таковым при использовании для этой цели бруцелл штамма Brucella melitensis Rev-1.

Учеными Казахского научно-исследовательского ветеринарного института (КазНИВИ) были апробированы две методики изготовления цветного антигена:

 

  • методика, предложенная Всесоюзным институтом экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ);
  • методика, рекомендованная Международным эпизоотическим бюро (МЭБ).

 

Результаты исследований

 

Технология изготовления цветного антигена по методу ВИЭВ слагается из нескольких этапов.

1) Выращивание на питательных средах и приготовление отдельных бактериальных взвесей из бруцелл штаммов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19. Приготовленные суспензии проверялись на чистоту и стерильность путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При отсутствии посторонней микрофлоры приготовленный антиген считается пригодным для окрашивания. Хранить антиген допускается в течение 2-3 недель в рефрижераторе при температуре +2…+6оС.

2) Протравливание бактериальной суспензии. В качестве протравы применяли 0,5%-ный раствор сернокислого железа окисного – Fe2(SО4)3. Необходимое количество сернокислого железа растворяли в горячей дистиллированной воде и доводили до кипения. Затем полученный раствор охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр с целью удаления красновато-темно-коричневого преципитата. Полученный фильтрат использовали в качестве протравы. Далее взвесь бруцелл в дистиллированной воде (расчетная концентрация 400-600 млрд м.к./см3) смешивали в соотношении 1:0,5 с протравой и выдерживали при температуре +45…+50оС в течение 20-30 минут. После чего смесь центрифугировали при 4 000-6 000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали до прежнего объема в 0,5%-ном фенолизированном физиологическом растворе.

camel23) Окрашивание. Красящий раствор готовили впрок. С этой целью брали насыщенный раствор алюмоаммонийных квасцов (NH4Al(SO4)·12H2O). Затем в 15,0-20,0 см3 этилового спирта растворили 2 г гематоксилина и добавили 100,0 см3 насыщенного раствора указанных квасцов. Этот раствор, помещенный в стеклянную колбу с широкой горловиной, облучали ультрафиолетовым светом при комнатной температуре в течение 7 суток. Полученный раствор краски фильтровали через фильтровальную бумагу и добавляли 25,0 см3 глицерина и столько же этилового спирта. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 4 недели для созревания. Затем раствор фильтровали через бумажный фильтр и хранили в закрытой емкости. Краска приобретала красновато-малиновый цвет. Перед употреблением раствор краски фильтровали через бумажный фильтр. Бактерийную суспензию окрашивали красящим раствором гематоксилина, взятого в оптимальной дозе, которую устанавливали титрацией. Для этого в 6 центрифужных пробирок наливали по 1,0 см3 протравленной взвеси бруцелл и микропипеткой добавляли красящий раствор в возрастающих дозах: в первую пробирку – 0,01 см3, во вторую – 0,015 см3, в третью – 0,02 см3 и т.д. Пробирки встряхивали, ставили в водяную баню при температуре +40…+45оС на 10 минут. По истечении этого времени центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 минут. По цвету жидкости над осадком определяли оптимальное количество красящего раствора. В первых двух пробирках надосадочная жидкость оставалась неокрашенной, в третьей пробирке – имела голубоватый цвет. Для окрашивания антигена была взята доза краски, указанная в третьей пробирке. Микробную взвесь окрашивали гематоксилином, взятым в оттитрованной дозе 0,02 см3, и после добавления раствора краски прогревали в водяной бане при температуре +40…+42оС в течение 15 минут. Затем окрашенную взвесь центрифугировали при 3 000-4 000 об/мин в течение 10-15 минут. Надосадочную часть декантировали, а осадок доводили фенолизированным физиологическим раствором до прежнего объема и после проверки активности, стерильности и специфичности использовали для дальнейших исследований.

4) Приготовление цветного антигена по методике МЭБ. Антиген для КМП с молоком готовили из клеточных суспензий инактивированных нагреванием штаммов B. abortus 19 и B. melitensis Rev-1, культивируемых, как описано выше. Бактериальные суспензии указанных штаммов центрифугировали при скорости 6 000 об/мин в течение 15 минут. После чего растворы ресуспендировали в растворе гематоксилина, который готовили по следующей методике: 100,0 см3 4%-ного заранее приготовленного гематоксилина растворяли в 95%-ном этаноле и добавляли к глицериновому раствору сульфата алюминия-аммония (5 г сульфата алюминия-аммония, 48 мл глицерина плюс 100 мл дистиллированной воды). К полученному раствору добавляли 2,0 см3 свежеприготовленного 10%-ного иодата натрия. После окрашивания в течение 30 минут при комнатной температуре темно-пурпурный раствор прибавляли к 940 см3 10%-ного раствора сульфата алюминия-аммония в дистиллированной воде, рН этой смеси доводили до 3,1. После чего раствор оставляли при комнатной температуре на 90 дней для созревания. Перед использованием раствор красителя встряхивали и фильтровали через вату. Осажденные клетки бруцелл суспендировали в растворе красителя до уровня 1 г на 30 см3 красителя и прогревали до 80оC в течение 10 минут. Окрашенные клетки осаждали центрифугированием и трижды промывали раствором хлорида натрия (6,4 г) с добавлением в него 85%-ной молочной кислоты (1,5 см3 на 1 л воды) и 10%-ного гидроксида натрия (4,4 см3), осадок взвешивали в 1,6 л дистиллированной воды с конечным рН=3,0. Промытые клетки ресуспедировали до уровня 1 г на 27 мл разбавителя, состоящего из 0,5%-ного физраствора с фенолом, доведенного до уровня рН=4,0 добавлением 0,1 М лимонной кислоты (примерно 2,5 мл на 1 л) и 0,5 М фосфата натрия (примерно 1 мл на 1 л), и выдерживали 24 часа при температуре +4оC. Смесь фильтровали через вату, доводили рН до уровня 3,1. Объем осажденных клеток доводили до 4%. Полученный антиген проверяли на чувствительность и специфичность и использовали для дальнейшей работы.

camel3Цветной антиген, полученный из штаммов B. abortus 19 и B. melitensis Rev-1, применяли при изучении частоты случаев выделения возбудителя бруцеллеза с молоком верблюдиц.

Диагностическую ценность определяли путем постановки реакции с молоком от лактирующих животных с добавлением в него позитивной и негативной сывороток. Дальнейшее проведение изучения указанного вопроса осуществляли путем взятия материала от лактирующих верблюдиц (секрет молочной железы, кровь) и проведения серологических и бактериологических исследований.

Было подвергнуто исследованию 46 проб молока верблюдиц. Пробы исследовали отдельно из каждой доли вымени с помощью кольцевой молочной пробы и осадочной реакции. Сыворотку крови исследовали в РБП, РА, РСК. В итоге, при исследовании молока и сыворотки крови положительный результат был получен в двух случаях. При постановке биопробы культуру бруцелл выделить не удалось (в результате серологических исследований биопробных животных получен отрицательный четырехкратный результат – через 15, 21, 45 и 60 дней после введения биоматериала).

При сравнительной оценке эффективности коммерческого диагностикума для исследования молока верблюдиц (из бруцелл вида B. abortus 19 и B. melitensis Rev-1), приготовленного нами по методике ВИЭВ и МЭБ, а также бивалентного цветного антигена, были исследованы 18 проб молока животных, носителей бруцелл вида B. melitensis Rev-1.

Данные по сравнительному определению диагностической ценности цветных антигенов, приготовленных из разных штаммов по видовой принадлежности по методикам ВИЭВ и МЭБ, и коммерческого препарата приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Данные исследования проб молока с цветным антигеном

 

Кол-во проб

Результаты КМП с антигеном

Комм. из бруцелл штамма B. abortus 19

Опытными образцами из штаммов

B. abortus 19

B. melitensis Rev-1

ВИЭВ

МЭБ

ВИЭВ

МЭБ

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

18

Абс.

15

3

15

3

15

3

18

18

%

83

17

83

17

83

17

100

100

Контроль

Абс.

3

3

3

3

3

%

100

100

100

100

100

 

Как видно, из данных, приведенных в табл. 1, наличие антител к бруцеллам вида B. melitensis более полно обнаруживается с помощью гомологичного диагностикума.

В связи с этим, учеными КазНИВИ был приготовлен бивалентный диагностикум из бруцелл вида B. abortus 19 и B. melitensis Rev-1.

Далее было исследовано молоко, полученное от 18 верблюдиц, с антигенами из штаммов B. abortus 19 и B. melitensis Rev-1, а также бивалентным цветным антигеном. Полученные при этом результаты приведены в табл. 2.

 

Таблица 2. Данные исследования проб молока верблюдиц с цветным антигеном

 

Кол-во проб

Результаты КМП с антигеном

Комм. из бруцелл штамма B. abortus 19

Опытными образцами из штаммов

B. abortus 19

B. melitensis Rev-1

Бивалент. антиген 19+ Rev-1

ВИЭВ

МЭБ

ВИЭВ

МЭБ

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

Пол.

Отр.

18

Абс.

2

16

2

16

2

16

2

16

2

16

2

16

 

%

11,1

88,9

11,1

88,9

11,1

88,9

11,1

88,9

11,1

88,9

11,1

88,9

 

Как видно, из данных, приведенных в табл. 2, бивалентный антиген показывает позитивные результаты в таком же количестве, что и препараты из монокультуры.

Таким образом, в случае появления антител в организме верблюдов к бруцеллам вида B. melitensis приготовленный диагностикум позволит обнаруживать их в исследуемом материале в более полном объеме.

 

А.Т. Арысбекова, Н.П. Иванов, А.М. Намет, Ф.А. Бакиева, Р.С. Саттарова, К.М. Шыныбаев (ТОО «Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт»)

Смотрите также

milk-cow

Рациональный подход к использованию потенциала молочных коров

Исследования отечественных ученых привели к созданию пяти новых молочных типов скота в юго-восточном и северном ...

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *